内容简介

分为四个部分24章。第*部分总结了对寄主昆虫的研究进展，包括寄主昆虫种质资源及其分化、生物学特性、适应高海拔环境的生理生化机制等；第二部分总结了冬虫夏草发育生物学、冬虫夏草菌与寄主昆虫和高寒草甸植物的跨界共生、冬虫夏草个体的真菌群落等方面的研究进展，提出了冬虫夏草菌与寄主昆虫、高寒草甸植物跨界共生的新理论，是本书的理论创新；第三部分总结了影响冬虫夏草发生的环境因子，包括高寒草甸植被、土壤、寄主昆虫天敌等；第四部分对资源可持续利用技术进行了总结，包括寄主昆虫牧虫繁育工程技术、冬虫夏草自然孕育工程技术等。

序
前言
引论1
0.1冬虫夏草研究简史2
0.2冬虫夏草资源面临的问题2
0.3冬虫夏草资源可持续利用的途径3
0.4本书的主要内容3
第*部分寄主昆虫生物学研究
第1章寄主昆虫的生物学特性7
1.1蒲氏钩蝠蛾不同发育阶段的生物学7
1.2蒲氏钩蝠蛾幼虫的食性与空间分布16
1.3实验种群生命表22
第2章寄主昆虫的种群分化24
2.1抽样与数据分析24
2.2基于形态标记及生物学的色季拉山钩蝠蛾种群分化29
2.3基于分子标记的色季拉山钩蝠蛾种群分化41
第3章寄主昆虫适应高寒环境的生理生化基础53
3.1幼虫血淋巴能量物质的变化动态54
3.2脂肪酸脱饱和酶基因及其表达动态59
3.3热激蛋白基因及其表达动态70
第4章寄主昆虫适应高海拔环境的转录组学特征92
4.1蒲氏钩蝠蛾幼虫转录组测序及分析92
4.2蒲氏钩蝠蛾幼虫适应不同海拔生境的基因表达分析107
4.3蒲氏钩蝠蛾幼虫RNA-Seq及DGE结果的QRT-PCR验证120
第5章寄主昆虫的模式识别受体125
5.1蒲氏钩蝠蛾β-1,3-葡聚糖识别蛋白126
5.2蒲氏钩蝠蛾载脂蛋白TpapoLp-Ⅲ145
5.3模式识别蛋白基因对白僵菌侵染的响应表达154
第6章寄主昆虫的共生原生动物簇虫161
6.1蒲氏钩蝠蛾血腔内寄生簇虫的形态与结构161
6.2蒲氏钩蝠蛾寄生簇虫的rDNA序列及系统进化分析165
6.3蒲氏钩蝠蛾肠道内寄生簇虫的荧光原位杂交检测171
6.4蒲氏钩蝠蛾寄生簇虫Ascogregarinasp.生活史及物种特征175
第二部分冬虫夏草发育生物学研究
第7章冬虫夏草菌与寄主昆虫的共生发育181
7.1检测冬虫夏草菌的qPCR方法181
7.2冬虫夏草菌对寄主昆虫的定殖190
7.3寄主幼虫被冬虫夏草菌致病后的生理和形态变化192
第8章冬虫夏草菌与植物的跨界共生196
8.1跨界共生的形态学证据196
8.2跨界共生的分子证据205
8.3跨界共生的生物学及生态学意义213
8.4冬虫夏草菌跨界共生的生活史214
第9章冬虫夏草个体中的真菌群落
9.1真菌的分离鉴定
9.2不同时期冬虫夏草中的真菌群落结构218
9.3讨论224
第10章寄主昆虫幼虫肠道中的真菌群落227
10.1试验用寄主幼虫及肠道真菌DNA的提取227
10.2肠道真菌群落结构228
10.3讨论229
第11章冬虫夏草菌与寄主幼虫互作的转录组学特征236
11.1冬虫夏草菌与寄主幼虫转录组测序236
11.2冬虫夏草菌与寄主幼虫互作前后有参转录组结果247
11.3寄主幼虫，罹病前后元参转录组257
第12章每虫夏草的寄生真菌267
12.1样品采集及显微结构267
12.2寄生真菌的分离培养与形态特征269
12.3寄生真菌GIMCC3.570的nrDNA序列与系统发育273
12.4寄生真菌对冬虫夏草子座喷发子囊抱子时长和子囊抱子产量的影响275
12.5讨论279
第三部分冬虫夏草适生地生态环境研究
第13章影响冬虫夏草发生的环境因子283
13.1寄主昆虫283
13.2海拔分布283
13.3气候条件284
13.4土壤因子286
13.5食物因子286
13.6天敌因子287
13.7过载放牧287
13.8掠夺式采挖288
13.9存在的问题与展望288
第14章冬虫夏草适生地植物群落289
14.1样地设置与植被调查289
14.2植被群落组成292
14.3植物群落特征299
14.4讨论303
第15章冬虫夏草适生地土壤特性305
15.1样地设置与样品采集、测定305
15.2土壤特征306
15.3土壤特征与植物群落和寄主幼虫密度的相关性分析308
第16章土壤真菌群落与主要虫生真菌310
16.1土壤总DNA提取310
16.2土壤真菌群落结构312
16.3土壤中的冬虫夏草菌315
16.4土壤中的拟青霉317
16.5土壤中的白僵菌丰度319
第17章冬虫夏草适生地草甸地表节肢动物群落的多样性H323
17.1样地设置与标本采集、分析323
17.2地表节肢动物群落的结构326
17.3地表节肢动物群落年际动态335
17.4讨论336
第18章冬虫夏草适生地草甸地表节肢动物群落的相似性340
18.1数据与分析方法340
18.2全部物种在不同生境中的相似性342
18.3优势类群在不同生境中的相似性比较346
18.4天敌类群在不同生境中的相似性比较349
18.5讨论
第19章寄主昆虫的节肢类天敌355
19.1幼虫期寄生性天敌悬茧蜂355
19.2踊期寄生性天敌姬蜂374
19.3成虫期捕食性天敌376
19.4卵期天敌385
19.5不同生境地表天敌种群动态385
19.6陷阱法防治地表节肢类天敌效果评价387
第四部分冬虫夏草资源可持续发展研究
第20章冬虫夏草寄生昆虫391
20.1寄主昆虫分属检索表392
20.2属征及其种类组成392
20.3钩蝠蛾属3新种397
第21章寄主昆虫种质的原位繁育406
21.1采集并活体保存的寄主昆虫种质资源406
21.2大棚原位繁育407
21.3草甸原位繁育407
21.4寄主昆虫种质原位繁育技术体系的集成
第22章冬虫夏草子座发育的生物学411
22.1西藏色季拉山冬虫夏草子座的发育411
22.2子囊孢子416
22.3子囊孢子的喷射动态421
第23章冬虫夏草的原位孕育426
23.1示范基地概况426
23.2原位孕育的主要技术措施427
23.3原位孕育效果428
23.4冬虫夏草原位孕育技术系统集成428
第24章冬虫夏草资源可持续发展面临的主要问题、对策与途径430
24.1面临的主要问题430
24.2对策433
24.3途径435
24.4结语437
主要参考文献438
附录1西藏色季拉山高寒草甸植物图谱458
附录2西藏色季拉山高寒草甸地表节肢动物图谱472
后记484

引论
冬虫夏草［Ophiocordyceps sinensis（Berk.） Sung, Sung, Hywel-Jones & Spatafora］（Sung et al., 2007）是一种虫生子囊真菌，属于真菌界（Fungi）的子囊菌门（Ascomycota）粪壳菌纲（Sordariomycetes）肉座菌目（Hypocreales）蛇形虫草科（Ophiocordycipitaceae）蛇形虫草属（Ophiocordyceps）。主要分布于我国青藏高原高海拔区域（肖生荣等，1983；杨大荣， 2008），北起祁连山，南至滇西北的高山，东自川西高原山地，西达喜马拉雅的大部分地区，包括青海（玉树、果洛、黄南等州）（刁治民，1996；王宏生， 2001）、西藏（那曲、昌都、林芝、山南等地区）（陈仕江等，1999）、四川（甘孜、阿坝等州）（尹定华等，1990）、云南（迪庆、丽江、大理等地）（沈发荣等，1988）、甘肃（甘南、临夏、陇南等州）（马启龙等，1995）等省（自治区）都有分布。喜马拉雅山周边国家如尼泊尔、不丹、锡金和印度等也有少量分布。
冬虫夏草的寄主为钩蝠蛾属（Thitarodes）昆虫幼虫，属于节肢动物门（Arthropoda）昆虫纲（Insecta）鳞翅目（Lepidoptera）蝙蝠蛾科（Hepialidae）。钩蝠蛾属目前已知有 42种（邹志文，2009；邹志文等， 2010；Zou et al., 2011），为完全变态昆虫，世代发育包括卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段，其中蛹、成虫和卵三个发育阶段在同一年内完成，而幼虫发育时间漫长，为 3～5年，具体时间因种及生态环境而异，具有典型的世代交替现象（李泉森等， 1991；李峻锋等，2011）。
学界普遍认为，冬虫夏草菌的世代发育包括无性（anamorphosis）和有性（teleomorphosis）两个阶段（蒋毅和姚一建，2003）。中国被毛孢（Hirsutella sinensis Liu, Guo, Yu & Zeng）是冬虫夏草的无性型阶段菌种（Jiang and Yao，2002），zui适发育温度为 10～15℃（沈南英等， 1983）。每年夏天，部分寄主昆虫幼虫被冬虫夏草菌致病，冬虫夏草菌在幼虫体腔内利用寄主体内积累的营养物质繁殖生长，直至菌体充满寄主体腔，寄主死亡变为僵虫，此为冬虫夏草菌的无性阶段。来年春天，僵虫头部长出子座并露出地表，随后子囊果发育并喷发子囊孢子，为有性阶段。因此，冬虫夏草菌的世代发育实际上与寄主昆虫的世代发育相交接，以幼虫为交接点（图 0-1）。冬虫夏草菌完成一个世代发育的时间为 1年，而寄主昆虫则需要 3～5年才能完成一个世代的发育。
图0-1冬虫夏草菌及其寄主昆虫的世代发育
Figure 0-1　Generation development of Ophiocordyceps sinensis and its host insects
0.1冬虫夏草研究简史
0.1.1古代药性描述阶段
冬虫夏草特殊的药用功效很早以前已被人们所认识和利用。早在唐中宗时，金城公主嫁到西藏带去的医药书籍《月王药诊》（公元710年）中，已有“牙儿札更布”（冬虫夏草的藏语称谓 )的记述，描述了其能“治肺部疾病”。稍后（公元 780年）的《藏本草》记载了冬虫夏草具有“润肺、补肾”的功能。清代（公元1694年），汪昂在《本草备要》中对冬虫夏草已有翔实记载：“冬虫夏草，冬在土中，形如老蚕，有毛能动，至夏则毛出土上，连身俱化为草”；其性味功用为“甘、平”“保肺益肾、止血化痰、已劳嗽”。其他典籍如《酉阳杂俎》《图鉴》《吾三卷香》《金汁甘露宝瓶札记》《甘露宝库》《寿世保元》《本草从新》和《本草纲目拾遗》等也有冬虫夏草药效的记载。由此可见，我们的祖先早在 1300多年前就已经认识了冬虫夏草及其特殊功效：“补肺、强肾、益精气，理诸虚百损”“功与人参、鹿茸同，但药性温和，老少病虚者皆宜食用。”
0.1.2 现代调查研究阶段
冬虫夏草的现代研究始于1958年，中国科学院动物研究所资源昆虫室通过对四川康定一带的野外考察，认为“冬虫夏草的寄主昆虫是虫草蝙蝠蛾（Hepialus armoricanus Oberthür）”（陈鲁泰等，1973），首次明确了冬虫夏草的寄主昆虫种类，也证实了“冬天是虫、夏天是草”名称的由来。此后，对冬虫夏草寄主昆虫种类的调查进入了一个小高潮，陆续有冬虫夏草寄主昆虫新种的报道。
与此同时，对冬虫夏草及其寄主昆虫生物学和生态学的研究也逐渐增多。进一步明确了分布在青藏高原不同产区的冬虫夏草为同一个物种，均为冬虫夏草菌Ophiocordyceps sinensis，而寄主昆虫则存在种类差异。同时，明确了温湿度、光照和降水等气候因素对冬虫夏草菌发育的影响（张古忍等，2011）。其间还有低海拔繁育寄主昆虫和尝试人工培育冬虫夏草的报道（高祖等，1991；俞永信，2004）。
关于冬虫夏草药理活性的研究报道也在增多，并陆续发现了一些代表性的化合物，如虫草素、腺苷、麦角甾醇、多糖、甘露醇和氨基酸等（刘高强等，2007），《中华人民共和国药典》也因此将腺苷（C10H13N5O4）规定为冬虫夏草质量控制的指标成分，并陆续证实了冬虫夏草在抑制肿瘤、抗癌和显著提高人体免疫功能等方面的独特功效（Ng and Wang, 2005; Buenz et al., 2005）。
0.2冬虫夏草资源面临的问题
冬虫夏草分布于青藏高原高海拔区域，生长范围局限，产量极为有限。随着人们生活水平的提高，冬虫夏草的市场需求在持续扩大，冬虫夏草已成为zui为昂贵的中*材品种。冬虫夏草的价格从 1997年到 2004年增长了350%，2010年在中国沿海城市等地的零售价格已达到了每千克10万～40万元。
冬虫夏草产区的区域自然条件极端恶劣，自然灾害频繁，农牧民生产生活条件十分艰苦，农牧民收入水平低，是集中连片的贫困地区，贫困面广、贫困程度深。采挖冬虫夏草在产区经济社会发展中起着举足轻重的作用，当地藏民家庭现金收入的 70%以上来源于采挖冬虫夏草（Winkler，2008），所创造的年产值在许多县都超过了1000万元，如西藏自治区丁青县的冬虫夏草年产值超过 5500万元，收入占该县国内生产总值的 60%以上（金幸奇， 2003）。
受经济利益的驱使，过度采挖冬虫夏草的趋势日益加剧，产地生态环境、冬虫夏草菌世代发育循环及寄主昆虫遭受不同程度破坏。同时，随着全球气候变暖，雪线上升，使冬虫夏草的分布海拔从 20世纪50～80年代初的 2800～5000 m上升至现在的 4200～5200 m（Stone, 2008；杨大荣，2008），分布空间受到严重压缩，资源蕴藏量急剧下降，已被列入《国家重点保护野生植物名录》（国家林业局，1999）。冬虫夏草资源能否可持续利用不仅关系到这一珍贵自然资源的生存和繁衍，还关系到产区农牧民的生计及经济社会发展的问题。
0.3冬虫夏草资源可持续利用的途径
如其他濒危生物资源一样，冬虫夏草资源可持续发展的途径无外乎有两条，一是开发替代品减少对自然资源的依赖；二是对自然资源实施原位保护，通过人工干预增加自然资源蕴藏量。
发酵培养冬虫夏草菌丝体是冬虫夏草替代品开发的主要途径（沈南英等，1985，1997），生产的冬虫夏草菌丝体和发酵产物可作为替代冬虫夏草的药品或保健品原料，已获得广泛应用（柯传奎，2005）。近年来，也有工厂化培育冬虫夏草成功的传闻，但未见正式文字报道，这不失为一条替代品开发的有效途径，但其利弊有待进一步评价。
近 10年来，笔者所在团队对冬虫夏草自然资源的原位保护和自然孕育进行了探索，提出了冬虫夏草可持续发展的新思路，即从青藏高原冬虫夏草自然孕育形成过程的原生态自然条件出发，选育寄主昆虫优良种质，建立寄主昆虫种子繁育园，优化高寒草甸环境，调控影响寄主昆虫繁育的关键因子如寄主昆虫天敌等，恢复冬虫夏草适生地生态系统的多样性和良性循环，获得大量寄主昆虫优质虫卵，并将获得的虫卵控释在冬虫夏草适生地高寒草甸，提高草甸土壤中的寄主幼虫密度，进而实现冬虫夏草的自然孕育。实践证明，这是实现冬虫夏草资源可持续发展的有效途径。
0.4 本书的主要内容
本书是笔者所在团队近10年来对冬虫夏草资源可持续发展基础理论和关键技术研究的阶段性总结，分为 4个部分共 24章。第*部分总结了对寄主昆虫生物学研究的进展，包括寄主昆虫的生物学特性、种群分化、适应高海拔环境的生理生化机制和共生原虫等；第二部分总结了冬虫夏草发育生物学的研究进展，包括冬虫夏草菌与寄主昆虫和高寒草甸植物的跨界共生、冬虫夏草个体中的真菌群落、寄主昆虫肠道真菌群落、冬虫夏草菌与寄主幼虫互作的转录组学特征及冬虫夏的寄生真菌等，其中冬虫夏草菌与寄主昆虫、高寒草甸植物的跨界共生是zui新发现的理论成果，并据此提出了冬虫夏草菌跨界共生的生活史；第三部分总结了对冬虫夏草适生地草甸生态环境研究的进展，包括影响冬虫夏草发生的环境因子、冬虫夏草适生地草甸植物群落、土壤特性、土壤真菌群落与主要虫生真菌、草甸节肢动物群落的多样性与相似性、寄主昆虫不同发育阶段节肢类天敌等；第四部分对冬虫夏草资源可持续发展面临的问题和对策进行了探讨，并在厘清寄主昆虫种质资源和明确冬虫夏草子座发育的基础上，对制约资源可持续发展的寄主昆虫繁育和冬虫夏草自然孕育两大关键技术进行了探讨，指出了冬虫夏草资源可持续发展的途径。
第*部分 寄主昆虫生物学研究
寄主昆虫是冬虫夏草发生的营养与物质基础，也是冬虫夏草资源可持续发展的物质基础。了解寄主昆虫的生物学特性，是维持其种群稳定进而促进冬虫夏草资源可持续发展的前提。
由于分布地自然环境的特殊性和开展研究的困难性，迄今对寄主昆虫生物学还知之有限。根据已有文献报道推测，多数寄主昆虫种类应该属于狭域分布。主要原因有，一是卵和蛹没有运动能力，穴居在土壤中的幼虫只能在隧道中上下活动，成虫期短暂，而且初羽化的雌成虫怀有大量已经发育成熟的卵，导致腹部沉重，不具有远距离飞行与扩散的能力；二是青藏高原复杂多样的自然生态环境，如区域辽阔、峡谷割裂深切、江河交错和峰峦重叠等发挥了事实上的地理隔离作用，限制了不同种群之间的基因交流，促进了种群对局部生境条件的适应分化；三是青藏高原高寒缺氧的特殊环境，寄主昆虫种群在行为和生理上产生特化，以适应严酷环境的胁迫。
以西藏色季拉山分布的蒲氏钩蝠蛾［Thitaro-des pui（Zhang et al.）］为主要研究对象，对其生物学和生活史、种群分化、对高海拔环境适应的生理生化与遗传机制、与病原物互作的分子基础、共生原虫等进行了系统研究，获得了许多第*手资料，其中大多为第*次发现与报道，对详细了解寄主昆虫的生长发育与种群繁衍具有重要的理论意义。